Fundamentos del Método
Cuando el antigeno Ag, presente en la muestra, penetra en la superficie del agar, reacciona con el anticuerpo especifico, produciendo un precipitado circular que se redisuelve y forma nuevamente a mayor distancia del punto de siembra. Esto se debe a que en los primeros momentos, la reaccion se desarrolla en la zona de exceso de anticuerpo.Este proceso se repite continuamente durante las primeras 48 hs, hasta que finalmente se alcanza el punto de equivalencia Ag-Acpo y la difusión cesa. En este momento, el área del precipitado, incluyendo el orificio de siembra resulta directamente proporcional a la cantidad de antígeno (x) presente en la muestra.En la practica, el area del ppdo. Se reemplaza por el diametro al cuadrado d². Por lo que:
d²=mx+d0
Donde m es la pendiente de la curva de calibración y d0 la ordenada al origen.
La pendiente m de la curva de calibracion es funcion de:
-La especificidad del antisuero (IgA, IgG, Transferrina etc)
-Distintos lotes de la misma placa
-Volumen de muestra aplicado
Es decir que la pendiente de la curva de calibracion m sera la misma para todas las placas del mismo lote y especificidad si se mantiene el volumen de muestra.
El valor de d0 (ordenada al origen) es funcion del diametro del pocillo y del volumen de la muestra e independiente de la especificidad del antisuero.
Como el diametro del pocillo es el mismo para todas las placas RID Plate (2,7 mm), aqui tambien la unica variable que afecta a d0 es el volumen de muestra y esto ( a diferencia de m) es independiente de la especificidad y lote de la placa fig 2.
Un estudio de 80 lotes de RID Plate de distinta especificidad, dio un valor medio de d0 de 11,87 mm2.Este valor se puede tomar como referencia siempre que el volumen de muestra sea de exactamente 5 μl.
El diametro en el punto de equivalencia es funcion de la relacion antigeno/anticuerpo.
Como la cantidad de anticuerpo para todas las placas de un lote dado es el mismo, la unica variable que tiene incidencia en la pendiente de la curva de calibracion es el volumen de la muestra.
Por lo tanto, la exactitud de los resultados obtenidos empleando la Tabla de Valores de Referencia provista con cada placa, depende de la exactitud del volumen de muestra aplicado ya que este afecta a la pendiente y en menor medida a la ordenada al origen.
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