Redes Sociales

Procedimiento

Materiales

-RID Plate. Placas para 15 determinaciones, conteniendo anti suero  especifico para la proteína a medir.Los anti sueros policlonales son desarrollados en cabra empleando antígenos altamente purificados y eventualmente absorbidos por cromatografía en fase solida para eliminar reacciones inespecificas. Cada placa incluye una Tabla de valores de Referencia especifica para el lote indicado.

-Pipetas de desplazamiento positivo con capacidad de dispensar 5 ul de muestra, con una precision de 0,1 ul. Se sugiere tipo Hamilton o similar. Volumen 0-10 ul.

-Objetivo graduado, abaco u otro dispositivo que permita medir el diámetro con unas sensibilidad de 0,1 mm

Precaución: utilizar guantes y observar las medidas de bioseguridad durante todo el  procedimiento.
Muestras. Plasma obtenido con EDTA o suero humano.
Luego de centrifugar, controlar que no queden restos celulares o de fibrina que puedan obstruir la pipeta o dar lugar a mediciones erróneas.
Los anti sueros empleados son específicos para proteínas humanas y por lo tanto no pueden utilizarse en al cuantificación de proteínas de otras especies animales.
El empleo de RID Plate para cuantificar proteínas en otros líquidos biológicos es posible, pero no ha sido ensayado por nuestra Empresa. En todos los casos, las muestras deben ser previamente centrifugadas y los resultados y valores de referencia validados.

Abrir el envase por el lugar marcado, encima del Zipper. Las placas poseen anilinas coloreadas que permiten diferenciarlas rápidamente. Los colores coinciden con los de las Tablas de Referencia.
Controlar  fecha de vencimiento y  lote grabados en la placa y verificar que coincidan con la Tabla de Valores. No utilizar fuera de la Fecha de vencimiento.Destapar y permitir que se evapore el exceso de humedad si lo hubiere.
El sobre provisto es un trilaminado con barrera gas no permeable, lo que evita la deshidratación de la placa durante toda su vida útil. Puede ser utilizado como cámara húmeda una vez en uso, asegurándose de cerrar el zipper correctamente. En caso de uso continuado, la placa puede mantenerse a temperatura de laboratorio (20-25 C) hasta por lo menos un mes sin variación en su desempeño. Caso contrario mantener a 2-8 C.  NO CONGELAR.

Colocar la placa en superficie horizontal, preferentemente con luz oblicua que permita visualizar con claridad el borde de los pocillos.
Para la aplicación de la muestra, se recomienda el empleo de jeringas de desplazamiento positivo.

La utilización de pipetas automáticas a desplazamiento de aire, como las que se ven en el fondo de la imagen, no es recomendable ya que por lo general carecen de la precisión y exactitud requerida en ese rango de lectura.
En ambos casos es buena practica calibrar las pipetas * y verificar** periódicamente la calibración de las mismas de acuerdo a las normas de calidad implementadas en el laboratorio. Puede encontrar el instructivo de calibración aquí * y el de verificación rápida aquí.

Agregar 5 ul de muestra o control en las posiciones designadas. En caso de rotura del borde o que la muestra se derrame fuera del orificio, la misma no es válida y debe ser repetida en otra posición.
El empleo de controles es recomendable, pero los mismos no siempre coinciden entre sí, tienen trazabilidad a estándares internacionales o son estables. En caso de duda puede consulte nuestro departamento técnico.
Controles  “in house” pueden ser preparados por el mismo usuario a partir de pooles de 100 + muestras, alicuotados y conservados a – 20 C.
No es válido cavar pocillos adicionales  entre los existentes. Al producirse la reaccion Ag Acpo. parte del antisuero disponible es consumido por los pocillos adyacentes, dejando la zona entre ambos con una concentración relativamente menor de anticuerpo y afectando por lo tanto el diámetro alcanzado en el punto de equivalencia.

Una vez sembrada, mantener la placa destapada hasta que penetren todas las muestras en el agar. En la foto se observa que la muestra en posición 8 aun no lo ha hecho. Esto permite una difusión homogénea y la formación de un frente de migración mas definido.Una vez finalizado este proceso (un timer a los 5’ nunca esta de mas) cerrar la placa firmemente,La posición invertida no es imprescindible, pero, al igual de lo que ocurre con los medios de cultivo en cápsulas de Petri, evita la condensación y caída de gotas en la superficie del agar.La temperatura de incubación, no afecta el resultado del ensayo dentro del rango 2-37 C° (ver efecto de la temperatura), pero puede disminuir la actividad del anti suero (por ejemplo si se la mantiene por semanas superiores a 30 C°).

Las placas RID Plate poseen catalizadores de la reacción Ag Acpo, lo que permite que para la mayoría de las placas, el punto final de la reacción se alcance a las 24 hs. para diámetros menores a 7,5 mm.
Existen excepciones, como en el caso de IgM, en la que el PM del pentamero hace su difusión mas lenta, por lo que el punto final se alcanza entre 48 y 72 hs.
Por otro lado, la intensidad del anillo de precipitación, es decir la cantidad de proteína precipitada, aumenta en las 48 hs posteriores al fin de la difusión, lo que determina que en algunos casos (IgM, IgA BC)  los diámetros sean mas fácil de visualizar pasado este periodo. Esto es particularmente cierto cuando no se posee lupa graduada.

El tiempo incubación previo a la lectura de los resultados depende de el metodo a emplear:
-Cinético con curva de calibración-18 hs

-Punto final con Curva de calibración 48 hs

-Punto final Con Tabla de Valores de Referencia 24 hs para diámetros menores a 7,5 cms, 48 hs para diámetros superiores.

Medir los diámetros con una precisión de 0,1 mm. El empleo de lupa graduada es recomendable sobre

Registrar diámetros medidos junto a la identificación de cada paciente y trazar la curva de calibración o emplear la  Tabla de Referencia para obtener los resultados.

La utilización de Tablas de Referencia es el método mas empleado.
Las Placas RID Plate son precalibradas en fábrica empleando Standares Internacionales y controles propios con trazabilidad a los mismos. Las Tablas de Referencia se calculan con metodos estadísticos, que permiten  extrapolar la concentración de la proteína a medir en condiciones controladas y son especificas para cada lote.

Para asegurar la validez de la Tabla y por ende  de los resultados se recomienda:

-Incluir controles con cada lote nuevo de placas y verificar que los mismos entren en un rango de diámetro +/- 0,2 mm del esperado.

-Verificar periódicamente la calibración del material volumétrico.

 

3

 

.