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Electroforesis

Importante. La presente es una ilustracion del procedimiento que no reemplaza al Instructivo del producto-

1. Reactivos e instrumental necesarios:

• Progel. Tiras de acetato de celulosa gelificado-Ver presentaciones

• Buffer Barbital (Veronal) BG 1000/1010-BG 1000/1010

• Solución Colorante Amido Black CP 1000

• Solución Decolorante DE 1000/1010

• Fuente y Cuba electroforesis

• Sembrador

• PROSOFT. Software cuantificar las fracciones empleando escáner común y tiras no transparentizadas.

2. Abrir el sobre, las tiras no usadas deben conservarse en un recipiente cerrado con una concentración de Metanol entre 20 y 40%. Previo a su utilización,  equilibrar en buffer Barbital 10-20 minutos. No emplear la fuente de electroforesis ni el buffer de corrida para incubar, ya que el metanol absorbido en las tiras, altera el pH y fuerza iónica del buffer de corrida y restos de acetato pueden adherirse a los electrodos.

3. Agregar el buffer Barbital hasta el nivel indicado en la cuba. De serposible, inclinar, como muestra la figura, para equilibrar el volumen de líquido en ambos lados de la misma.

Muestra: suero  (no emplear plasma). En el caso de utilizar otras muestras biologicas, clarificar previamente por centrifugacion.De ser necesario concentrar (el limite de sensibilidad del metodo es 0,03 mg/dl).

La utilizacion de materiales biologicos distintos a suero humano, debe ser validada por el profesional responsable.

4. Secar cada tira, individualmente (rollo absorbente de papel de cocina es aceptable).

La formulacion de PROGEL permite mantener las tiras en contacto con el aire por periodos superiores a 15 minutos sin que sufran deterioro alguno. Esto da mayor margen de maniobra al operador durante el procedimiento. Aplicar las muestras de acuerdo a las instrucciones de uso de su sembrador.

La tira debe usarse con el lado opaco hacia arriba (el extremo cortado, abajo a la derecha).

5. Colocar en la cuba formando un "puente" simétrico entre ánodo y cátodo, de manera que los extremos sumergidos en el buffer tengan aproximadamente la misma longitud. Tapar y correr inmediatamente para evitar la difusión de la muestra.

6. -PRECAUCION ALTO VOLTAJE. Antes de continuar con el siguiente paso, asegurese de conocer el funcionamiento de la fuente de poder y cuba. Bajo ninguna circunstancia toque ni abra la cuba mientras esta conectada a la red electrica. Luego de finalizada la corrida y desconectada fuente de poder,  se recomienda esperar un par de minutos para permitir la disipacion de eventual corriente estatica.

Aplicar un Voltaje constante de entre 150 V/ 30 minutos (preferido) hasta 200 V /22 minutos (1-1,5 mA/cm). Es decir aproximadamente 3-4 mA por tira de 2,5*17).Cada laboratorio debe determinar las condiciones óptimas de corrida de acuerdo a su equipamiento (fuentes, cuba, electrodos etc).

Se recomienda no reutilizar el Buffer, pero en caso de hacerlo mezclar previamente los depósitos anionico y cationico, ya que el pH de cada uno será diferente luego de la corrida.

7. Colorear por espacio de 5 a 30 segundos en colorante Amido Black- Amido Black CP 1000. Este colorante ha sido formulado especificamente para PROGEL:

-Permite periodos de coloracion cortos.

-Disminuye la coloracion inespecifica y la precipitacion de proteinas entre las fracciones lo que permite obtener una mayor resolucion y separacion clara de alfa1/alfa2 y beta1/beta2

-Decoloracion mas rapida.

Al efectuar la coloracion, se recomienda sostener las tiras manualmente para evitar la tincion  de los extremos  y disminuir asi la cantidad de colorante retenido.

8. Decoloración: enjuagar una vez con decolorante usado y varias veces con sucesivos cambios solución decolorante nueva (es preferible efectuar varios cambios de volúmenes pequeños a pocos cambios de grandes volumenes).

De ser posible  agitar en forma permanente.

9. Evaluacion:

La inspección visual de la tira, es el paso más importante en la evaluación de un proteinograma.

El escaneo posterior cuantifica, pero no reemplaza al ojo del observador experimentado.

10.Cuantificación. Nuestra Empresa ha desarrollado PROSOFT un software de digitalización y procesamiento de imágenes, que permite analizar, modificar y cuantificar los resultados, empleando un simple escáner comercial y tiras sin transparentizar. Consulte por la versión beta del mismo.

En caso de que sea necesario transparentizar, consultar manual de instrucciones aqui