Características
PROCEDIMIENTO
Paso 1
Materiales
-RID Plate. Placas para 15 determinaciones, conteniendo anti suero especifico para la proteína a medir.Los anti sueros policlonales son desarrollados en cabra empleando antígenos altamente purificados y eventualmente absorbidos por cromatografía en fase solida para eliminar reacciones inespecificas. Cada placa incluye una Tabla de valores de Referencia especifica para el lote indicado.
-Pipetas de desplazamiento positivo con capacidad de dispensar 5 ul de muestra, con una precision de 0,1 ul. Se sugiere tipo Hamilton o similar. Volumen 0-10 ul.
PROCEDIMIENTO
Paso 2
-Objetivo graduado, abaco u otro dispositivo que permita medir el diámetro con unas sensibilidad de 0,1 mm
Precaución: utilizar guantes y observar las medidas de bioseguridad durante todo el procedimiento.
Muestras. Plasma obtenido con EDTA o suero humano.
Luego de centrifugar, controlar que no queden restos celulares o de fibrina que puedan obstruir la pipeta o dar lugar a mediciones erróneas.
Los anti sueros empleados son específicos para proteínas humanas y por lo tanto no pueden utilizarse en al cuantificación de proteínas de otras especies animales.
El empleo de RID Plate para cuantificar proteínas en otros líquidos biológicos es posible, pero no ha sido ensayado por nuestra Empresa. En todos los casos, las muestras deben ser previamente centrifugadas y los resultados y valores de referencia validados.
PROCEDIMIENTO
Paso 3
Abrir el envase por el lugar marcado, encima del Zipper. Las placas poseen anilinas coloreadas que permiten diferenciarlas rápidamente. Los colores coinciden con los de las Tablas de Referencia.
Controlar fecha de vencimiento y lote grabados en la placa y verificar que coincidan con la Tabla de Valores. No utilizar fuera de la Fecha de vencimiento.Destapar y permitir que se evapore el exceso de humedad si lo hubiere.
El sobre provisto es un trilaminado con barrera gas no permeable, lo que evita la deshidratación de la placa durante toda su vida útil. Puede ser utilizado como cámara húmeda una vez en uso, asegurándose de cerrar el zipper correctamente. En caso de uso continuado, la placa puede mantenerse a temperatura de laboratorio (20-25 C) hasta por lo menos un mes sin variación en su desempeño. Caso contrario mantener a 2-8 C. NO CONGELAR.
PROCEDIMIENTO
Paso 4
Colocar la placa en superficie horizontal, preferentemente con luz oblicua que permita visualizar con claridad el borde de los pocillos.
Para la aplicación de la muestra, se recomienda el empleo de jeringas de desplazamiento positivo.
La utilización de pipetas automáticas a desplazamiento de aire, como las que se ven en el fondo de la imagen, no es recomendable ya que por lo general carecen de la precisión y exactitud requerida en ese rango de lectura.
En ambos casos es buena practica calibrar las pipetas * y verificar** periódicamente la calibración de las mismas de acuerdo a las normas de calidad implementadas en el laboratorio. Puede encontrar el instructivo de calibración aquí * y el de verificación rápida aquí.
PROCEDIMIENTO
Paso 5
Agregar 5 ul de muestra o control en las posiciones designadas. En caso de rotura del borde o que la muestra se derrame fuera del orificio, la misma no es válida y debe ser repetida en otra posición.
El empleo de controles es recomendable, pero los mismos no siempre coinciden entre sí, tienen trazabilidad a estándares internacionales o son estables. En caso de duda puede consulte nuestro departamento técnico.
Controles “in house” pueden ser preparados por el mismo usuario a partir de pooles de 100 + muestras, alicuotados y conservados a – 20 C.
No es válido cavar pocillos adicionales entre los existentes. Al producirse la reaccion Ag Acpo. parte del antisuero disponible es consumido por los pocillos adyacentes, dejando la zona entre ambos con una concentración relativamente menor de anticuerpo y afectando por lo tanto el diámetro alcanzado en el punto de equivalencia.
PROCEDIMIENTO
Paso 6
Una vez sembrada, mantener la placa destapada hasta que penetren todas las muestras en el agar. En la foto se observa que la muestra en posición 8 aun no lo ha hecho. Esto permite una difusión homogénea y la formación de un frente de migración mas definido.Una vez finalizado este proceso (un timer a los 5’ nunca esta de mas) cerrar la placa firmemente,La posición invertida no es imprescindible, pero, al igual de lo que ocurre con los medios de cultivo en cápsulas de Petri, evita la condensación y caída de gotas en la superficie del agar.La temperatura de incubación, no afecta el resultado del ensayo dentro del rango 2-37 C° (ver efecto de la temperatura), pero puede disminuir la actividad del anti suero (por ejemplo si se la mantiene por semanas superiores a 30 C°).
PROCEDIMIENTO
Paso 7
Las placas RID Plate poseen catalizadores de la reacción Ag Acpo, lo que permite que para la mayoría de las placas, el punto final de la reacción se alcance a las 24 hs. para diámetros menores a 7,5 mm.
Existen excepciones, como en el caso de IgM, en la que el PM del pentamero hace su difusión mas lenta, por lo que el punto final se alcanza entre 48 y 72 hs.
Por otro lado, la intensidad del anillo de precipitación, es decir la cantidad de proteína precipitada, aumenta en las 48 hs posteriores al fin de la difusión, lo que determina que en algunos casos (IgM, IgA BC) los diámetros sean mas fácil de visualizar pasado este periodo. Esto es particularmente cierto cuando no se posee lupa graduada.
PROCEDIMIENTO
Paso 8
El tiempo incubación previo a la lectura de los resultados depende de el metodo a emplear:
-Cinético con curva de calibración-18 hs
-Punto final con Curva de calibración 48 hs
-Punto final Con Tabla de Valores de Referencia 24 hs para diámetros menores a 7,5 cms, 48 hs para diámetros superiores.
Medir los diámetros con una precisión de 0,1 mm. El empleo de lupa graduada es recomendable sobre
Registrar diámetros medidos junto a la identificación de cada paciente y trazar la curva de calibración o emplear la Tabla de Referencia para obtener los resultados.
PROCEDIMIENTO
Paso 9
La utilización de Tablas de Referencia es el método mas empleado.
Las Placas RID Plate son precalibradas en fábrica empleando Standares Internacionales y controles propios con trazabilidad a los mismos. Las Tablas de Referencia se calculan con metodos estadísticos, que permiten extrapolar la concentración de la proteína a medir en condiciones controladas y son especificas para cada lote.
Para asegurar la validez de la Tabla y por ende de los resultados se recomienda:
-Incluir controles con cada lote nuevo de placas y verificar que los mismos entren en un rango de diámetro +/- 0,2 mm del esperado.
-Verificar periódicamente la calibración del material volumétrico.
Fundamentos del método
Cuando el antigeno Ag, presente en la muestra, penetra en la superficie del agar, reacciona con el anticuerpo especifico, produciendo un precipitado circular que se redisuelve y forma nuevamente a mayor distancia del punto de siembra. Esto se debe a que en los primeros momentos, la reaccion se desarrolla en la zona de exceso de anticuerpo.Este proceso se repite continuamente durante las primeras 48 hs, hasta que finalmente se alcanza el punto de equivalencia Ag-Acpo y
la difusión cesa. En este momento, el área del precipitado, incluyendo el orificio de siembra resulta directamente proporcional a la cantidad de antígeno (x) presente en la muestra.En la practica, el area del ppdo. Se reemplaza por el diametro al cuadrado d². Por lo que:
d²=mx+d0
Donde m es la pendiente de la curva de calibración y d0 la ordenada al origen.
Fig 1 Ej.Placa C3; m=0,2947; d0=11,749La pendiente m de la curva de calibracion es funcion de:
-La especificidad del antisuero (IgA, IgG, Transferrina etc)
-Distintos lotes de la misma placa
-Volumen de muestra aplicado
Es decir que la pendiente de la curva de calibracion m sera la misma para todas las placas del mismo lote y especificidad si se mantiene el volumen de muestra.
El valor de d0 (ordenada al origen) es funcion del diametro del pocillo y del volumen de la muestra e independiente de la especificidad del antisuero.
Como el diámetro del pocillo es el mismo para todas las placas RID Plate (2,7 mm), aquí también la única variable que afecta a d0 es el volumen de muestra y esto ( a diferencia de m) es independiente de la especificidad y lote de la placa fig 2.
Un estudio de 80 lotes de RID Plate de distinta especificidad, dio un valor medio de d0 de 11,87 mm2.Este valor se puede tomar como referencia siempre que el volumen de muestra sea de exactamente 5 μl.
Fig 2. Variacion de la pendiente y en menor medida de la ordenada en curvas de calibracion de la misma placa de IgA en funcion del volumen de muestra ap;icado (3,4,5 y 6 μl)
Conclusión
El diametro en el punto de equivalencia es funcion de la relacion antigeno/anticuerpo.
Como la cantidad de anticuerpo para todas las placas de un lote dado es el mismo, la unica variable que tiene incidencia en la pendiente de la curva de calibracion es el volumen de la muestra.
Por lo tanto, la exactitud de los resultados obtenidos empleando la Tabla de Valores de Referencia provista con cada placa, depende de la exactitud del volumen de muestra aplicado ya que este afecta a la pendiente y en menor medida a la ordenada al origen.
Reseña Histórica
El surgimiento de métodos inmuno cromatográficos, a mediados del siglo pasado, permitió el aislamiento de proteínas humanas con alto grado de pureza. Como resultado de ello fue posible obtener antisueros policlonales de alto titulo y especificidad, lo que finalmente condujo al desarrollo de diversas metodologías para el análisis cuali y cuantitativo de proteínas plasmaticas. La Inmunodifusión Radial Cuantitativa fue el primer procedimiento analitico que permitio cuantificar en forma sencilla, precisa y exacta la concentracion de proteinas especificas en liquidos biologicos. *Por su simplicidad, rapidez y escaso requerimiento tecnico, continua hoy siendo el metodo de referencia y la alternativa de eleccion en pequeños y medianos laboratorios.
El método se basa en la reacción entre un antígeno y su correspondiente anticuerpo, disuelto en una matriz semisólida de agar. Cuando el antígeno presente en la muestra o control, se introduce en un pocillo cavado en el gel que contiene el anticuerpo, se forma un precipitado visible. El mismo tiene forma de anillo que se va expandiendo en la medida que el antígeno difunde radialmente desde el punto de siembra. Al alcanzar el punto de equivalencia, la difusión se detiene y en ese momento el área del precipitado es directamente proporcional a la cantidad de antígeno presente en la muestra.
* Mancini G., Carbonara A. O. and Heremans J. F., Immunochemistry, 2, 235 (1965).